精准识别肿瘤诊断和预后的密切相关的生物标志物，如蛋白质和RNA，对肿瘤及早诊断和治疗具有重要作用。MicroRNA（miRNA）被是肿瘤早期诊断和治疗的有效生物标志物，如何建立稳定、高效且灵敏度高的miRNA成像方法，保证结果的可靠性和一致性，是制约 miRNA 成为早期诊断临床应用的一个关键环节。RNA荧光适配体是一段能够特异性地结合小分子荧光团，并诱导和增强其发光的RNA序列。RNA荧光适配体较荧光蛋白更易于编辑，具有信噪比高、细胞毒性低、特异性强以及光稳定性好等优势，为胞外和活细胞内功能性物质的可视化研究提供了新的强有力工具。

近期，冠军白菜策略网cmp8论坛李长明教授，郭春显教授，谷雨副教授课题组报道了一种基于熵驱动的链取代反应结合荧光RNA适配体技术，成功实现了体内miRNA高灵敏度成像。MiRNA作为靶分子，引发熵驱动的链取代反应，从而释放大量的Corn适配体并点亮DFHO的荧光。该方法不需要结构复杂的tRNA支架，即可高效的自组装成光稳定性好的荧光结构，成功实现了活细胞和体内内源性miRNA分子的高选择性成像。相关成果以“In Vivo Imaging MicroRNA with Bright Fluorescent RNA Aptamer through Target-Mediated Entropy-Driven Toehold Exchange”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.4c00510）。该论文的通讯作者为冠军白菜策略网cmp8论坛李长明教授，郭春显教授，谷雨副教授和2022级研究生白瑞为共同第一作者。

研究的主要内容

具体成像原理如图一所示，该体系由两部分组成：一个单链（S1）和由两个DNA单链S2、S3和一个Corn适配体反应生成的底物（S）的三链结构。其中，S3与Corn适配体和S2部分互补，因此S具有三个不稳定的立足点，以诱导链置换反应进行。在没有目标物的情况下，S1无法与S反应，链取代反应无法进行，但当加入目标miRNA后， 底物S中的S2链首先与miRNA之间的发生链取代反应，形成S3、Corn和T的不稳定三链结中间体（I1），并暴露含有4个核苷酸单链结构（5'-AACT-3'）的尾链。这种亚稳结构的中间体可继续和S1发生链取代反应，释放RNA适配体Corn和目标RNA。同时，释放的目标RNA会触发另一个熵驱动的链取代反应，从而释放更多的Corn适配体。该适配体可形成头对头的G-四链体二聚体结构，结合并激活DFHO的荧光，在活细胞内（图二，图三）和体内（图四）实现了不同丰度miRNA的精准成像。

图一：基于熵驱动的链取代反应和荧光RNA适配体实现微小RNA的体内成像原理

图二：(A)细胞内miR-125b成像示意图。(B)用DFHO转录S和S1在PC-3细胞中共聚焦成像细胞内miR-125b。对照细胞仅用DFHO孵育，所有比例尺对应为25 μm。(C)用Leica 3D 成像获得的PC-3细胞用DFHO转录S和S1的3D合并图像的平面和截面图。(D)荧光信号的统计直方图。(E)用EDTE-DFHO(黄色)、DFHO(绿色)和对照细胞(紫色)转染PC-3细胞的流式细胞术分析。

图三： 使用EDTE-DFHO对不同细胞中miR-125b表达水平的共聚焦图像图及相关荧光统计直方图。所有比例尺均为25 μm

图四：(A) Hela细胞成瘤的小鼠体内miRNA-21成像示意图。(B)瘤周注射探针和DFHO后，不同时间点的小鼠miR-21荧光成像：a. 对照组；b (1.3 cm) 和c (2.0 cm) 为不同肿瘤体积的小鼠。(C)图6B中肿瘤部位的荧光强度。(D)转染探针24h后小鼠肿瘤的染色组织学切片。标尺:50µm。

本研究报告了一种通过熵驱动的链取代反应对 miRNA 进行高灵敏度和选择性成像的通用性策略，其中 miRNA 充当催化链来启动熵驱动的链取代反应，并不断反馈循环释放适配体Corn，从而点亮 DFHO 的荧光，极大的增强了荧光信号的强度。该体系选择性好，避免了荧光染料的预修饰和荧光蛋白的长时间表达，仅需要简单的核酸结构，而不是茎环，tRNA折叠等复杂的二级结构，即可实现目标物的荧光信号放大，并成功应用于细胞和体内成像。与报道的基于Corn的“一对一”成像模型相比，该方法对相同miRNA细胞内成像的信噪比显著提高了4.6倍。此外，通过更改探针的识别单元，可实现包括miRNA-125b和miRNA-21在内的不同miRNA的高灵敏度成像，具有普适性，为研究肿瘤相关 miRNA 的功能和相互作用提供了潜在的工具，在临床诊断和预后中具有指导作用。